医学论文哪里有？本课题通过稳定上调和瞬时下调HeLa细胞中Dynamin表达后进行EMCV感染，结果提示Dynamin上调显著增加EMCV在HeLa细胞中的复制增殖，反之，Dynamin下调显著抑制EMCV感染HeLa细胞。提示Dynamin正向调控EMCV感染HeLa细胞。
第一章 文献综述
2 发动蛋白Dynamin研究进展
2.1 Dynamin结构与功能
1989年，Shetner和Vallee首次从小牛大脑中分离出Dynamin，并证实了Dynamin可以诱导微管形成六边形排列的束型结构[37]。Dynamin是鸟苷三磷酸酶(Guanosine triphosphatase,GTPase)家庭成员蛋白，多肽链约由871个氨基酸组成，分子量约为100 kDa，由GTPase结构域(1-299 AA)、中间结构域(300-511 AA)、pleckstrin同源性结构域(Pleckstrin homology domain,PH,511-622 AA)、GTPase效应器结构域(GTPase effector domain,GED,623-750 AA)和C末端的富含脯氨酸结构域(Prolone-rich domain,PRD,751-871 AA)组成[38, 39]（图1.2）。GTPase结构域是Dynamin中高度保守区域，与GTP的结合与水解相关[40]，中间结构域参与Dynamin环状四聚体的自组装[41]，PH结构域具有较低的脂质特异性，与磷脂酸肌醇结合有关[42]，GED结构域与GTPase结构域、中间结构域结合形成二聚体，主要参与多个Dynamin间的相互作用[43]，PRD结构域是多种信号和细胞骨架蛋白相互作用区域[40]，主要将Dynamin招募到内吞位点，协调Dynamin在内吞途径中发挥作用[44]。
2方法
2.1 HeLa细胞复苏及传代培养
（1）从液氮罐中取出冻存的HeLa细胞， 37℃快速融化。
（2）300g×离心10min，弃去上清，加入1mL完全培养基，轻轻吹打混匀。
（3）将细胞悬液转移至T25无菌细胞培养瓶，置于细胞培养箱中，37℃、5% CO2条件下培养。
（4）当细胞融合度达到90-95%后进行传代。弃去旧培养液，加入1mL胰酶，倒置显微镜下观察分离成为单个细胞后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀后取1mL细胞悬液加入新的无菌细胞培养瓶中，加入适量完全培养基，于37℃、5% CO2条件下培养。
2.2 Dynamin抑制剂Dynasore浓度筛选
（1）在96孔细胞培养板中接种HeLa细胞进行培养，当细胞融合度达70-80%时，弃去旧培养基。
（2）加入预先配置好20µM、40µM、80µM和160µM 5种不同浓度Dynamin抑制剂Dynasore，每个浓度的抑制剂设3个重复孔，以及一个空白对照组，空白对照组中加入等量DMSO和完全培养基的混合液。
（3）将细胞培养板放入细胞培养箱中于37℃、5% CO2条件下培养24h后，使用Proliferation细胞活力检测试剂盒（Promega）进行细胞活力检测，筛选出不影响细胞活力的最佳Dynasore浓度。
3结果
3.1 EMCV感染HeL a细胞与Rab5有关而与Rab7无关
3.1.1早期内体标志物EEA1、晚期内体标志物LAMP1与EMCV共定位检测
将HeLa细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞融合度达到20-40%时，进行EMCV感染试验，接毒量为10MOI，接毒后37℃孵育1h，弃去含有病毒的上清液，加入2.5% NBS DMEM细胞维持液，放入细胞培养箱中37℃孵育2h和3h，用70%乙醇4℃过夜固定，对目的蛋白及细胞核进行染色。IFA结果显示（图3.1），EMCV VP1蛋白绿色荧光分布在细胞质中，与早期内体标志物EEA1蛋白红色荧光分布位置重合，表明EEA1与EMCV存在共定位。而LAMP1与EMCV并未显示出共定位。综上所述，EMCV病毒粒子侵入HeLa细胞后进入早期内体，而不经过晚期内体。
3.2 Rab5、Rab7蛋白参与EMCV感染He La细胞机制
3.2.1 Rab5、Rab7蛋白表达量对EMCV吸附的影响
（1）Rab5、Rab7蛋白上调后不影响EMCV对HeLa细胞的吸附
在6孔细胞培养板中接种HeLa细胞，待细胞融合度达到90%后，分别转染1µg pcDNA3.1质粒、1µg pcDNA3.1-Rab5质粒、1µg pcDNA3.1-Rab5 S35N质粒、1.5µg pcDNA3.1-Rab7质粒和1.5µg pcDNA3.1-Rab7 T22N质粒。转染48h进行EMCV感染试验，接毒量为1MOI。按照第二章试验2.17方法进行吸附试验，收集细胞检测EMCV 3D基因表达量，以转染pcDNA3.1空载细胞为对照组。结果显示，与对照组相比，过表达Rab5、Rab7、Rab5 S35N、Rab7 T22N组的EMCV3D基因表达量均无显著差异（图3.11, p>0.05）。综上所述，Rab5、Rab7蛋白瞬时上调后不影响EMCV在HeLa细胞上的吸附。
第四章 全文结论
1. Dynamin抑制剂Dynasore抑制EMCV感染HeLa细胞，间接说明Dynamin在EMCV感染HeLa细胞过程中发挥作用。
2. 运用慢病毒包装技术构建获得稳定过表达Dynamin的HeLa细胞系HeLa-Dyn2。第10代和第20代HeLa-Dyn2中Dynamin蛋白表达量、基因表达水平高而稳定，对细胞生长活力亦无影响。
3. Dynamin蛋白表达稳定上调后可以显著促进EMCV感染HeLa细胞。蛋白下调会显著抑制EMCV感染HeLa细胞。
4. Dynamin表达量改变不影响感染过程中EMCV吸附HeLa细胞。Dynamin稳定上调后极显著促进EMCV侵入HeLa细胞，表达量下调极显著抑制EMCV侵入，Dynamin还参与EMCV侵入HeLa细胞后的运输过程。
5. EMCV侵入HeLa细胞后进入早期内体，不经过晚期内体。早期内体关键蛋白Rab5主要在病毒感染HeLa细胞3h后发挥作用，晚期内体关键蛋白质Rab7不影响EMCV感染HeLa细胞。
6．Rab5蛋白表达上调后可以显著抑制EMCV感染HeLa细胞，蛋白表达下调会显著促进EMCV感染HeLa细胞。Rab7蛋白表达上调后不影响EMCV感染HeLa细胞，但Rab7蛋白下调后会通过影响Rab5表达量间接抑制EMCV感染HeLa细胞。
7. Rab5和Rab7蛋白不影响EMCV感染过程中吸附HeLa细胞，Rab5蛋白在病毒侵入细胞过程中发挥抑制作用，但Rab7蛋白不影响病毒吸附和侵入细胞。Rab5蛋白不仅参与EMCV侵入HeLa细胞后的运输过程，也参与后续病毒入核，而Rab7不参与EMCV感染HeLa细胞。
参考文献（略）
