农学论文哪里有？本研究将为今后杨梅凋萎病菌致病机制的深入解析、杨梅中互作蛋白的筛选以及凋萎病的绿色防控奠定基础。
1文献综述
1.1杨梅
杨梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是杨梅科（Myricaceae）杨梅属（Myrica）的常绿亚热带果树，作为我国传统特色水果已经具有两千多年的种植历史[1]。杨梅主要在我国南方包括浙江、福建、贵州等多省栽培种植[2]，其中浙江杨梅种植面积和产量占全国第一，品种及生产技术在全球领先[3]。种植杨梅帮助当地农民增收，具有很高的经济价值[4]。杨梅因其独特的风味和口感是许多人喜爱的水果，果实含糖量较高且富含维生素，其含钾量也是所有水果中最多的，也常被加工成如蜜饯、果汁等产品，具有很高的营养价值[5]。杨梅还具有消食消暑、止泻利尿以及生津止渴等作用，其果实、叶片、树根等器官的多种提取物有抗癌和抗氧化的作用，在医学上可用作收敛剂、强心剂、健胃剂、皮肤药和创伤药等[6,7]，有很高的药用价值。杨梅树四季常青，枝叶浓密，还能减尘减噪，可作小区和公园的绿化树种，具有可观的观赏价值[8]。不仅如此，杨梅树体还耐贫瘠，有很好的固氮和保持水土的能力，具有一定生态意义[9]。杨梅喜疏松土壤，尤其是排水性良好的微酸性砂质红壤，且大多为山地栽培[10]，能有效利用土地资源。我国杨梅种质资源丰富，表现出丰富的遗传多样性，不同品种的果实颜色、果实大小等各有差异[11]。浙江的荸荠种、东魁、丁岙梅、晚稻杨梅四大品种已成为全国性主栽品种[12]。
随着杨梅市场需求量的不断增加，其栽培面积也不断扩大，种植杨梅的经济效益日渐提高[13]。杨梅的主产区浙江在2021年的投产面积同比上年增加1.5万hm2左右，总产量也超过了25万t[14]。然而，杨梅凋萎病的发生，因其发病速度快、传染力强的特点，若不及时加以控制，将对杨梅产业的可持续发展造成严重影响[15]。
2凋萎病菌激发子蛋白鉴定与验证
2.1材料与方法
2.1.1试验材料
（1）菌株和质粒
凋萎病异色拟盘多毛孢菌株XJ27为实验室保存，质粒pGR107、pSUC2、pBinGFP4、pCH为实验室保存，所用感受态有DH5α大肠杆菌感受态（擎科）、GV3101农杆菌感受态（维地）、YTK12酵母感受态（百奥莱博），AGL-1农杆菌为实验室保存。
（2）材料准备
从保存的异色拟盘多毛孢斜面上取菌块在CM固体培养基上活化培养，倒置于25℃恒温光照培养箱光照12 h和黑暗12 h培养；
在蛭石与营养土一比一混匀的湿润混合营养土上均匀撒播本氏烟草种子，种子发芽7 d后移苗，在25℃光照培养箱光照16 h和黑暗8 h培养，平均3 d于托盘浇水，前期营养液与水交替使用，注意单株烟草的生长空间。
2.1.2激发子蛋白免疫诱导活性鉴定
通过生物信息学预测筛选到了几个糖苷水解酶家族蛋白，本研究对GH11和GH12家族的几个蛋白进行免疫活性鉴定。
3杨梅cD NA文库构建与筛库
3.1材料与方法
3.1.1试验材料
杨梅采自浙江省农业科学院实验区；凋萎病菌菌株XJ27和酵母菌株AH109均为实验室保存；酵母文库质粒pGADT7，诱饵质粒pGBKT7，带有诱饵基因质粒pGR107-PvXyn3均为实验室保存；引物合成和序列测序由北京擎科生物科技有限公司完成。
3.1.2文库构建
取健康的幼嫩杨梅枝条，固定在吸水花泥上，用较厚的CM平板活化凋萎病异色拟盘多毛孢菌，在平板上用打孔器均匀打下菌饼，然后用1 mL注射器的针头在幼嫩杨梅叶片表面刺穿，菌饼菌丝面朝下接种杨梅，整个枝条连同花泥一起置于一定尺寸的透明箱内，用保鲜膜封盖并扎孔透气，置于25℃恒温光照12 h和黑暗12 h的光照培养箱。分别在接菌0 d、1 d、2 d、3 d和4 d后取杨梅叶片，先液氮速冻再迅速转至-80℃冰箱保存。
3.1.2.1总RNA提取
Trizol法提取接种凋萎病菌各时期杨梅叶片总RNA：
（1）先用液氮预冷已酒精消毒的研钵、研棒和药勺，混合接种凋萎病菌各时期的杨梅叶片样品在液氮中充分研磨至粉末状，然后转移到RNase-free离心管中；
（2）按比例加入trizol，振荡摇匀后室温下静置5 min使其充分裂解；
（3）加入氯仿，振荡混匀后室温下放置10 min；
（4）4℃，12000 rpm离心15 min，吸取上层水相至一新的离心管中，加入异丙醇振荡混匀，-20℃放置10 min； （5）4℃，12000 rpm离心10 min，弃去上清废液；
（6）加入75%乙醇溶液，温和振荡离心管重悬管底的RNA沉淀；
（7）4℃，12000 rpm离心5 min，除净上清，重复操作一次，晾干离心管；
3.2结果与分析
3.2.1文库构建
凋萎病异色拟盘多毛孢接种杨梅叶片，在接种后3 d有明显病斑（图3.1A）。接种病菌后4 d中每间隔1 d取多片叶片液氮速冻后放-80℃冰箱保存，用于提RNA建库。Trizol法提取总RNA后，进行琼脂糖电泳检测，结果显示有清晰的28S和18S两条带（图3.1B），表明所提取的总RNA未发生降解且质量较好，可用于下游建库。
逆转录合成单链cD NA后，为了文库基因完整性，设计三框引物P1-F、P2-F、P3-F分别扩增ds cDNA，利用琼脂糖凝胶电泳对合成的三种ds cDNA进行检测，结果显示ds cDNA呈现弥散条带，表示mRNA已被成功逆转录且合成的ds cDNA质量较好（图3.1C）。进一步对混合纯化后的ds cDNA进行处理，琼脂糖电泳检测结果显示，ds cDNA条带弥散、没有亮带，500 bp以下几乎看不到条带，说明均一化与小片段去除成功（图3.1D）。
4结论
4.1结论
（1）从杨梅凋萎病异色拟盘多毛孢基因组中筛选鉴定到可以诱导本氏烟草细胞免疫坏死的GH11和GH12家族蛋白激发子GH11-3、GH12-2。通过酵母信号肽捕获验证了GH11-3和GH12-2的信号肽的分泌活性。亚细胞定位结果显示GH11-3和GH12-2于植物细胞外围行使其功能。进一步的致病力分析，将GH11-3重命名为PvXyn3，通过遗传转化同源重组敲除基因PvXyn3，凋萎病突变菌株的致病效果显著性降低。
（2）构建了高质量的杨梅酵母cD NA文库，文库库容约为1.78×108 cfu/mL，重组率为100%。以凋萎病激发子蛋白PvXyn3为诱饵蛋白，初步筛选了15个与PvXyn3蛋白互作的候选蛋白，并选择了4个候选蛋白克隆其基因全长进行了回转验证，结果有3个候选蛋白验证成功。文库的构建与初步筛选实践为之后的基因挖掘筛选打下坚实基础。
构建高质量的酵母cD NA文库是利用酵母双杂交技术筛选未知互作蛋白的关键，为病原菌与寄主植物之间互作机制的研究奠定基础，也为进一步制定有效的防治措施提供依据。构建的凋萎病菌诱导的杨梅酵母cD NA文库，不仅可以用于筛选与凋萎病菌诱饵蛋白相互作用的蛋白，也为挖掘更多基因提供文库支持。
参考文献（略）
