药学论文哪里有？本研究基于实验室研究，筛选一株流行ST34型鼠伤寒沙门菌变体S. 1,4,[5],12:i:-中携带的多重耐药IncHI2质粒作为研究对象。通过模拟鼠伤寒沙门菌生存环境中可能的压力，筛选不同理化条件对携带IncHI2质粒鼠伤寒沙门菌适应性的优势选择条件，并对其相关机制进行探索。
1 前言
1.2 IncHI2质粒耐药性及适应性研究进展
质粒是细菌细胞内独立于染色体外的遗传物质，是常存在于细胞质内的双螺旋、闭环DNA分子,可以通过自身复制进行世代传递。质粒具有不兼容性（Incompatibility，Inc），即在同一宿主菌中利用同一复制系统的两种质粒不可共存特性。基于质粒这一特性，2005年，有研究者运用基于PCR扩增的质粒复制子的方法（PCR based replicon typing，PBRT），将肠杆菌中的质粒分为以下主要类型：HI2、HI1、I1-γ、X、L/M、N、FIA、FIB、FIC、W、Y、P、A/C、T、K、B/O以及FrepB（FII、FIII、FIV和FIV突变体）和FIIs（沙门毒力质粒FII复制子）（Carattoli et al., 2005），以便于进行细菌中质粒流行、分布和质粒携带附属基因等相关研究。
IncHI2质粒是肠杆菌中第五大流行耐药性质粒，介导多种耐药基因，在沙门菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌等肠杆菌中广泛传播。IncHI2质粒常同时携带多种重要耐药基因共同转移，对细菌多重耐药性的传播起重要作用。比如：IncHI2质粒被认为是多重耐药oqxAB在鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌中传播的主要载体（Wong et al., 2016）。在欧洲，IncHI2携带blaC TX-M是blaC TX-M各种亚型在肠杆菌科中传播的主要方式（Garcia et al., 2007）。在肠杆菌中尤其是沙门菌和大肠杆菌中，发现IncHI2质粒常携带多种重要耐药基因，如oqxAB、bla CTX-M、fosA3和mcr-1等，而这些基因在IncHI2质粒耐药基因区常由IS26序列构成复合转座子结构，协同转移（Fang et al., 2016）。
3 结果与分析
3.1 oqxAB-IncHI2质粒p15E444序列特征及其介导耐药表型分析
3.1.1 质粒p15E444介导耐药表型分析
为分析质粒p15E444对鼠伤寒沙门菌耐药表型的贡献情况，采用琼脂稀释法测定鼠伤寒沙门菌15E444、ATCC 14028和接合子14028/p15E444对14种抗菌药物敏感性，结果如表11。
4 讨论
4.1 oqxAB-IncHI2质粒序列及耐药表型分析
本研究，首先通过二代与三代全基因组测序结合获得对野生IncHI2质粒p15E444完整质粒序列，并与大肠杆菌中发现的典型IncHI2型质粒pHNSHP45-2和鼠伤寒沙门菌中介导多重耐药的流行性IncHI2质粒pH XY0908进行序列比对分析，发现质粒p15E444质粒与两个质粒相似度都非常高，主要在质粒上多重耐药基因区存在差异。在典型IncHI2质粒上,通常一段umuC和dcm之间的6.3 kb左右多重耐药区，质粒p15E444上多重耐药区较短，相较于pHNSHP45-2在耐药基因区缺少两端携带IS26的一段3 kb左右多重耐药基因片段，其中包括了floR、cmlA和sul3等耐药基因。与质粒pHXY0908相比，主要缺失重要耐药基因mcr-1、blaC TX-M-14和fosA3，并且blaC TX-M-14-fosA3两端携带反向IS26序列，而mcr-1左侧携带ISApl1结构。IS26插入序列作为最常见的可移动元件之一，在革兰氏阴性菌中，大多数I类转座子均以IS26作为边界，由IS26及其构成的转座子，被称为移动基因库，携带多种耐药基因在细菌间以及细菌染色体和质粒间进行耐药基因转移（Harmer et al., 2016）。同时，质粒上携带oqxAB基因固定结构即为由两端IS26构成的Tn6010转座子（Li et al., 2019）。对质粒p15E444耐药表型分析，由于质粒携带多种耐药基因oqxAB/blaC TX-M-14/mcr-1/fosA3等，介导宿主ATCC 14028对喹乙醇、萘啶酸、氯霉素、头孢噻肟、氨苄西林、黏菌素、磷霉素等抗生素耐药性，同时降低对环丙沙星敏感性。表明，在多重耐药IncHI2质粒倾向于通过IS26形成转座子获得和转移多种耐药基因，进而改变宿主耐药表型，甚至适应性。
4.2 不同压力下携带oqxAB-IncHI2质粒鼠伤寒沙门菌竞争能力分析
为了能够以一种高通量的方法研究不同理化条件下多重耐药oqxAB-IncHI2质粒对宿主鼠伤寒沙门菌竞争能力影响。参考相关文献（Peters et al., 2019）。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，对宿主鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028进行了定点荧光基因标记。同时，为降低IncHI2质粒在细菌间转移能力结合文献报道（Wagner et al., 2013），对质粒接合转移区traJ基因进行无痕敲除。
控制单因素变量，在不同条件下进行，携带和不携带多重耐药oqxAB-IncHI2质粒鼠伤寒沙门菌竞争性实验。结果显示，对照组（无压力条件下），携带多重耐药oqxAB-IncHI2质粒对鼠伤寒沙门菌较不携带质粒菌株竞争能力弱，竞争指数为0.66。主要归因于IncHI2质粒本身作为大质粒，其在宿主内复制、转移和结合的生长周期中都需要消耗宿主原料及能量，对宿主的适应性代价造成（Carroll et al., 2018）；其次与携带耐药基因mcr-1和oqxAB等的表达同样对宿主菌有较强的适应度成本有关（Tietgen et al., 2018；Wang et al., 2017）。不同抗生素处理时，由于质粒携带耐药基因，在黏菌素、头孢噻肟、环丙沙星、萘啶酸和喹乙醇亚抑菌浓度下，对携带质粒p15E444宿主菌具有选择性（CI=2.18～8.18），竞争能力不同程度强于不携带质粒宿主菌。质粒不携带相关耐药基因的卡那霉素、庆大霉素和四环素，对携带质粒p15E444宿主菌不具备选择作用，与对照组结果一致。然而，值得注意的是，氟苯尼考对携带多重耐药oqxAB-IncHI2质粒鼠伤寒沙门菌的显著选择优势（CI=16.23），甚至高于由质粒上oqxAB介导的氯霉素（本研究耐药抗生素中选择性最强的抗生素）对携带质粒p15E444宿主菌的选择作用（CI=8.16）。通过对质粒p15E444序列分析发现，质粒p15E444对氯霉素的的耐药性仅与多重耐药oqxAB基因相关。本研究中，携带oqxAB-IncHI2质粒p15E444并未降低宿主菌ATCC 14028对氟苯尼考的敏感性。但氟苯尼考和氯霉素同属于酰胺醇类药物，并且oqxAB为多重耐药外排泵基因。
5 结论
本研究基于实验室研究，筛选一株流行ST34型鼠伤寒沙门菌变体S. 1,4,[5],12:i:-中携带的多重耐药IncHI2质粒作为研究对象。通过模拟鼠伤寒沙门菌生存环境中可能的压力，筛选不同理化条件对携带IncHI2质粒鼠伤寒沙门菌适应性的优势选择条件，并对其相关机制进行探索，结果表明：
（1）临床流行鼠伤寒沙门菌携带的多重耐药IncHI2质粒可介导宿主对多种抗生素耐药性，同时携带多种重要耐药基因，但不介导对氟苯尼考的耐药性。
（2）在无药物以及其他多种理化条件下携带oqxAB-IncHI2质粒对宿主鼠伤寒沙门菌具有适应性代价，但在氟苯尼考选择压力下，携带多重耐药oqxAB-IncHI2质粒宿主菌具有显著竞争优势。
（3）氟苯尼考平衡鼠伤寒沙门菌ATCC 14028携带多重耐药oqxAB-IncHI2质粒产生的适应性代价的最小选择浓度约250 ng/mL。
（4）oqxAB协助低浓度氟苯尼考促进携带oqxAB-IncHI2质粒宿主鼠伤寒沙门菌的竞争优势，独立于染色体上编码外膜通道蛋白tolC基因。
参考文献（略）
