桑叶水提物对高糖环境下成骨细胞作用的体内外探讨

医学论文哪里有？本研究证实了桑叶水提物在高糖环境下具有促进牙槽骨成骨的作用，是潜在的糖尿病牙周炎防治药物，为糖尿病牙周炎的临床诊疗提供了一种新思路。

桑叶水提物对高糖环境下成骨细胞的作用研究

1.4 主要试剂的配制

1.4.1 α-MEM完全培养基

在超净台中，取一定量的α-MEM培养基，按10%的比例加入胎牛血清和1%的双抗，充分混匀后，保存于4℃备用。

1.4.2 高糖α-MEM完全培养基的配制

葡萄糖的相对分子质量为180.16，称取4.50g的葡萄糖在超净台中，加入α-MEM完全培养基定容到50mL，待其完全溶解后，用 0.22μm的一次性滤器过滤，制备成500mM的母液，分装保存于-20℃。使用时，吸取40mL的α-MEM完全培养基，加入10mL的母液，配成100mM浓度的高糖完全培养基。从100mM的完全培养基中吸取25mL加入25mL的完全培养基中，配成50mM的工作液。

1.4.3 桑叶水提物药液的配制

称取10mg桑叶水提物粉末，加入1mL的高糖α-MEM完全培养基，待其完全溶解，用0.22μm的一次性滤器过滤后，配成10mg/mL桑叶水提物母液。取10mg/mL的母液100L，加入900L的高糖α-MEM完全培养基中，配成1mg/mL浓度的桑叶水提物药液。取1mg/mL的母液100L，加入900L的高糖α-MEM完全培养基中，配成100g/mL浓度的桑叶水提物药液。依次稀释，最终配成浓度为10mg/mL、1 mg/mL、100g/mL、10g/mL、1g/mL、100ng/mL、10ng/mL的桑叶水提物药液，分装保存于-20℃。

结果

1 DP大鼠建模结果

1.1 实验性糖尿病大鼠建模结果

对照组毛发茂密鲜亮(图2-2,A)，饮水量和摄食量正常，体重稳步增长，活动良好，反应快。与对照组相比，实验性糖尿病大鼠模型组，毛发稀疏，泛黄，失去光泽(图2-2,B)。出现典型的糖尿病症状“三多一少”，即出现饮水量和摄食量的增加，反而体重逐渐减轻，排尿量增多，垫料极易潮湿且有异味，每日需要多次更换垫料。活动减少，反应变慢，且多次测量大鼠空腹血糖均≧11.1mmol/L，满足上述条件说明，实验性大鼠糖尿病模型造模成功。

讨论

1.桑叶水提物对高糖环境下成骨细胞的影响

研究发现，在一定浓度和时间范围内的高糖环境不仅可以抑制成骨细胞的增殖和成骨分化，还可以并且降低成骨标记物Col-1、OPG、ALP等的表达[39]。MC3T3-E1细胞常被用于在体外模拟成骨分化，是被大多数研究认可的体外成骨细胞模型[40]。因此，本实验将MC3T3-E1细胞放入不同浓度的高糖培养基中分别培养1天、3天、5天和7天，通过CCK8法检测 MC3T3-E1在高糖环境下的增殖情况，用以筛选出合适的糖浓度用以在体外构建高糖环境模拟糖尿病患者体内的高血糖。研究结果发现，40mM浓度范围内的葡萄糖在短时间内非但不会抑制MC3T3-E1细胞的增殖，甚至在一定程度上还会促进其增殖。可能是由于葡萄糖本身就是培养细胞所需的营养物质，小范围内增加其生长所需的营养反而促进了细胞的增殖。50mM浓度的葡萄糖从第3天开始，显著抑制了MC3T3-E1细胞的增殖，从形态学来看，50mM浓度的高糖环境会导致细胞发生轻微形变，高浓度的葡萄糖会导致细胞大范围的死亡。故本实验选用50mM的糖浓度用以构建体外高糖细胞模型，与欧[41]等结果一致。

桑叶作为我国传统中药材，含有酚类、生物碱类、多糖类、氨基酸类等多种活性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎和抗肿瘤等药理作用。桑叶主要包括黄酮、多糖和生物碱等202种活性成分，其中22种对糖尿病及其并发症的治疗具有显著疗效[42]。本课题组前期研究发现，桑叶水提物可以在正常及炎症环境中促进成骨细胞的增殖和分化。因此本实验选用不同浓度的桑叶水提物和高糖培养基联合培养MC3T3-E1细胞，通过CCK8法分别检测其在1天、3天、5天和7天的增殖情况筛选出适宜的桑叶水提物浓度用以接下来的实验。研究结果表明，10mg/mL的桑叶水提物有明显的细胞毒性，从第三天开始，1mg/mL-1ng/mL浓度的桑叶水提物均可以在一定程度上促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的增殖。其中100μg/mL、10g/mL、1g/mL浓度的桑叶水提物效果最佳，用以后续实验。

2.桑叶水提物对糖尿病牙周炎大鼠的影响

综上所述，本研究采用葡萄糖构建体外高糖成骨细胞模型，证明高糖环境可以促进MC3T3-E1细胞的凋亡、氧化应激和炎症因子的产生，抑制成骨分化的能力。本实验首次证明桑叶水提物对高糖环境下MC3T3-E1细胞表现出良好的抗炎及抗氧化能力，抑制甚至逆转高糖环境引发的炎症反应和细胞氧化应激进而促进高糖环境中细胞的增殖活性、成骨分化功能及基质矿化能力。糖尿病合并牙周炎的致病机制十分复杂，单纯体外构建高糖细胞模型并不能完全模拟糖尿病在体内对骨损伤的致病机理。

因此通过本实验通过构建实验性糖尿病牙周炎大鼠模型进一步探讨桑叶水提物对DP的作用研究，为其后期应用于临床中DP的防治提供更多的理论和实践依据。 常用来构建牙周炎模型的动物有很多，其中鼠、狗、猴，因牙周组织结构与人类的结构一致，都可以用来构建动物模型。狗和猴因其体型较大，价格昂贵和操作困难等原因所以较少使用。大鼠因其组织结构与人类相似，操作简单且容易饲养，所以本实验选择大鼠。牙周炎造模的方法：括局部机械刺激法、炎症因子刺激法、高糖黏性饮食法等。等使用炎症因子刺激牙周组织诱发牙周炎，该方法的优点是周期短，操作简单。缺点是其所造成的模型是炎症因子刺激引起的急性炎症而非细菌引起的局部炎症。另一种方法则是通过局部机械刺激诱导牙周组织产生炎症反应，是目前大量使用的长期可靠的方法[82]。因此本实验结合各种实验的优缺点，选用牙周结扎法构建大鼠牙周炎模型。

不足与展望

本研究初步探索了桑叶水体物对糖尿病牙周炎的影响，为桑叶水提物用于防治糖尿病牙周炎提供了一定的实验和理论依据。然而本研究也有一定的局限性。首先，骨改建是由成骨细胞和破骨细胞共同作用的复杂过程，但本实验只研究了成骨细胞，并没有研究破骨细胞，因此在后续的研究中还需进一步验证桑叶水提物对破骨细胞的影响，从而使研究结果更加完善。其次，本研究虽然证明了桑叶水提物对糖尿病牙周炎大鼠有良好的抗炎和成骨的效果，但由于国际上尚未出现被广泛认可的可用于同时治疗糖尿病和牙周炎的药物，所以本实验设计中没有设立阳性对照组，这使得我们无法直接比较本研究方法与已有治疗方法的优劣，因此在后续的研究中仍需进行更深入的研究，以便为其应用于临床治疗提供更多的实验和理论依据。

本研究通过构建高糖细胞模型和糖尿病牙周炎大鼠模型研究了桑叶水体物对糖尿病牙周炎的影响。研究结果表明桑叶水提物可以促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的增殖，具有良好的抗炎、抗氧化以及促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。桑叶水提物还对糖尿病牙周炎大鼠有良好的降糖和抗炎效果，并且可以促进牙槽骨的形成和减少骨质的吸收。综上所述，本研究证实了桑叶水提物在高糖环境下具有促进牙槽骨成骨的作用，是潜在的糖尿病牙周炎防治药物，为糖尿病牙周炎的临床诊疗提供了一种新思路。

参考文献（略）