医学论文哪里有？笔者研究发现P.gingivalis促进肿瘤细胞分泌CCL20，并通过CCL20-CCR6轴招募Treg细胞，导致T细胞免疫功能耗竭，而促进OSCC的恶性进展。
1 研究内容与方法
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养
1.3.1.1 细胞复苏和换液
本实验所用OSCC细胞系有CAL27和SCC25，CAL27细胞在含有10%胎牛血清和1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM高糖培养基中培养。SCC25细胞在细胞专用培养基中培养。将买回的冻存细胞从干冰中取出，在37℃恒温水浴锅快速融化后行细胞复苏，具体步骤如下：
（1）实验前需要紫外灯灭菌超净台30 min。先打开超净台，用75%酒精擦拭台面，然后将实验中所需的材料放入超净台内，再打开紫外灯灭菌30 min。实验中所需要的试剂放入37℃恒温箱复温。复温后用酒精喷洒放入超净台内，实验中需戴一次性无菌无粉橡胶手套。
（2）提前将水浴锅的温度调至37℃，配完全培养基（10%胎牛血清和1%双抗（青霉素和链霉素）和DMEM高糖培养基），15 mL离心管内装6 mL完全培养基。
（3）当水温升至37°C时，从干冰中取出细胞，并迅速将其放入水浴锅中。待细胞解冻后（大约1 min），迅速将其转移到预先装有6 mL完培的15 mL离心管中进行离心，转速为1000 rpm，持续时间5 min。
（4）首先取出离心管，然后用75%的酒精对其外壁进行喷洒，随后将其置于超净台中进行操作。在去除管内细胞的上清液后，保留管内的细胞沉淀。接着，加入1 mL完培，并用移液枪轻轻吹打至均匀，形成单细胞悬液。最后，将这些细胞悬液转移到T25透气细胞瓶中，再加入大约4 mL的完培。在瓶身上标记细胞名称、代数和日期，然后将其放入37°C的5%CO2的细胞培养箱中进行培养。次日用倒置显微镜来检查细胞的贴壁情况以及细胞的当前状态。
2. 结果
2.1 P.gingivalis与CAL27和SCC25细胞共培养模型鉴定
以细菌/细胞（MOI=50）建立共培养模型，P.gingivalis与细胞共培养6 h后行免疫荧光检测，结果显示，绿色荧光标记的P.gingivalis与蓝色荧光标记的细胞核合并后，P.gingivalis位于肿瘤细胞的胞质中，表明细胞细菌共培养模型的成功建立，见图2-1。
讨论
1.P.gingivalis促进OSCC的发展
口腔中存在着复杂的细菌生态平衡系统，吸烟、心理压力、不良饮食习惯和慢性牙周炎可以改变这种平衡。口腔微生态失调，细菌有能力通过释放其毒素和代谢产物、激发局部和全身的炎症反应，以及调整宿主的免疫反应来加速OSCC的进展。在癌变过程中，细菌群落的组成发生了质和量的变化[31]。微生物群具有重要的局部作用，如屏障强化和粘膜免疫的建立，但它也发挥全身作用，包括调节代谢、炎症和免疫。在上皮屏障表面，微生物群的组成和特定物种的丰度影响炎症和免疫力，以及上皮和基质细胞的稳态[32]。西湖大学蔡尚团队在小鼠PyMT 肿瘤样本和人类乳腺癌患者中，成功检测到微生物群的存在, 细胞内细菌可以在肿瘤进展过程中直接调节宿主细胞的活力，这表明肿瘤内微生物群更有可能是肿瘤组织的内在和不可分割的组成部分，而不是于病原体感染而偶然出现[33]。头颈部癌症占所有肿瘤的5%，其中一半发生在口腔。OSCC是头颈部鳞状细胞癌的一个子集，占所有口腔癌的90%以上[34]。尽管手术技术、辅助放疗和化疗取得了进展，但OSCC的发病率似乎在全球范围内增加，5年总生存率仍然很低，约为50- 60%。吸烟、饮酒和嚼槟榔是口腔癌的主要危险因素[35]。其他可能的风险因素可能包括病毒感染、真菌感染和慢性牙周炎，而某些病例无法用任何已知的风险因素明确解释[36-37]。肿瘤内微生物群和肿瘤生物学之间的相互作用，特别是细菌对肿瘤的影响也越来越受到重视, 肿瘤内的细菌主要存在于细胞内，并且存在于癌细胞和免疫细胞中 [38]。口腔癌的发生也与细菌有关[39-40]。
2. CCL20、CCR6和Foxp3在OSCC组织中高表达
趋化因子CCL20与多种癌症的发病相关，目前已有报道在乳腺癌组织中CCL20的表达与肿瘤大小、肿瘤数量、血管浸润和肿瘤分化有关，并且CCL20高表达的患者复发率和生存率较低表达的患者差[53]。宫颈癌组织中CCL20的表达明显高于非肿瘤组织和正常对照组织[54]。在对FOLFOX方案化疗耐药的病例中，结直肠癌细胞中的CCL20表达水平显著升高，并与生存率下降密切相关。此外，结直肠癌细胞分泌CCL20并将Treg募集到肿瘤组织中，增强其化学抗性[55]。人OSCC中含有丰富的趋化因子CCL20，有利于CCR6+ Treg细胞的招募和保留，从而促进癌细胞的侵袭和肿瘤的进展[56]。最近也有研究表明在人口腔角质形成细胞中，来自P.gingivalis的LPS可引起CCL20的强表达。口腔上皮细胞可以成为趋化因子和细胞因子的来源，在体内平衡期间驱动局部免疫以介导宿主防御；然而，当慢性炎症占主导地位时，免疫可以转向组织破坏。因此，口腔上皮细胞通过释放趋化因子积极参与调节局部炎症环境受到越来越多的关注[57-58]。本研究通过IHC检测发现在OSCC癌组织中CCL20明显高于癌旁组织。同样，通过ELISA实验检测OSCC患者血清中CCL20的表达明显高于健康对照组血清中CCL20的表达。进一步通过体外实验建立细胞细菌共培养模型，通过qRT-PCR、WB和ELISA发现P.gingivalis和OSCC细胞共培养组中，CCL20的蛋白和mRNA明显高于对照组，说明P.gingivalis可能促进OSCC细胞中CCL20的分泌。
小结
1. OSCC病灶周围形成的“炎症微环境”主以 CD4+T 淋巴细胞为主，癌组织中 CCL20、CCR6 和 Foxp3 表达明显增高，并且三者之间有显著的正相关关系。
2. P.gingivalis促进肿瘤细胞分泌CCL20，通过CCL20-CCR6轴招募Treg细胞到OSCC的TME中，从而促进OSCC的恶性进展。
参考文献（略）
